Моноклональные антитела

Моноклональные антитела представляют собой один из самых значимых прорывов современной медицины. Эти молекулы находят широкое применение в лечении различных сложных заболеваний, включая злокачественные опухоли, аутоиммунные патологии, системные заболевания, болезни сердечно-сосудистой системы и ряд инфекций. Кроме того, препараты на их основе активно используются в диагностике, таких как иммуногистохимия, иммуноферментный анализ или проточная цитофлуориметрия. Таким образом, данный метод является важной составляющей современной медицины и медицины будущего.

Антитела, известные человечеству уже несколько десятилетий, играют ключевую роль в работе иммунной системы. Эти особые белки вырабатываются организмом для идентификации и нейтрализации чужеродных веществ — антигенов. Примечательно, что антитела обладают высокой специфичностью, что позволяет им распознавать и связываться с конкретными фрагментами антигенов, известными как детерминантные группы. Один антиген может содержать несколько таких групп, каждая из которых способна вызывать выработку различных антител.

Процесс образования антител регулируется особым образом в организме. Каждый тип антител синтезируется отдельной группой клеток-клонов. Если в организме требуется большое разнообразие антител, то формируется значительное число таких клонов. Когда антитела продуцируются одним клоном клеток, они называются моноклональными.

Ранее для производства антител применялась иммунизация животных с последующим забором плазмы, которая использовалась для создания иммунных сывороток, предназначенных для борьбы с токсинами (например, столбняка или дифтерии), вирусами или ядами. Однако во многих случаях требуется создание специфических антител, направленных на строго определённые детерминанты антигенов. В таких ситуациях традиционные методы оказываются недостаточными, и на помощь приходят более современные технологии.

Интеллектуальная собственность https://www.euroonco.ru

Способы получения моноклональных антител

Создание моноклональных антител — это многоэтапный и трудоёмкий процесс, включающий несколько ключевых шагов.

1. Иммунизация животных. На начальном этапе используются лабораторные животные, чаще всего мыши или крысы. Процедура иммунизации проводится для того, чтобы активировать лимфобласты — клетки, которые продуцируют необходимые антитела. После забора из организма, эти клетки теряют способность к длительному существованию в лабораторных условиях, даже если их поместить в питательные среды с ростовыми факторами. Чтобы сохранить их активность, лимфобласты объединяют со злокачественными миеломными клетками, которые обладают необходимыми свойствами для продолжительного культивирования.
2. Подготовка миеломных клеток. Одновременно с иммунизацией проводят обработку миеломных клеток. Эти клетки, помимо способности синтезировать антитела, обладают неограниченным жизненным потенциалом, позволяющим им бесконечно воспроизводить себя. Для их поддержания в жизнеспособном состоянии в лаборатории используются специализированные среды, содержащие ростовые факторы.
3. Гибридизация (слияние) лимфобластов и миеломных клеток. На этом этапе лимфобласты объединяются с миеломными клетками для создания гибридом — специализированных клеток, которые могут продуцировать моноклональные антитела и обладают свойством неограниченного деления. Чтобы стимулировать процесс слияния, клетки обрабатываются специальными веществами, изменяющими структуру мембран и способствующими образованию цитоплазматических контактов. В результате формируются клетки с двойным набором хромосом — дикарионы. Однако для производства моноклональных антител нужны только те дикарионы, которые образовались в результате слияния лимфобласта и миеломной клетки.
4. Отбор гибридных клеток. Для выделения жизнеспособных гибридом применяются специальные растворы, которые создают условия, в которых выживают только гибридомы и лимфобластные дикарионы. Последние вскоре погибают из-за отсутствия способности к бесконечному делению, а гибридомы сохраняются и продолжают своё развитие.
5. Реклонирование гибридомных клонов. После отбора жизнеспособных гибридом проводят их реклонирование. Этот процесс необходим для того, чтобы получить отдельные клоны клеток, каждая из которых производит антитела с однородной структурой и свойствами. Реклонирование позволяет обеспечить высокую стабильность и качество конечного продукта.
6. Определение и отбор гибридом, продуцирующих моноклональные антитела. На данном этапе проверяют, какие из полученных гибридом вырабатывают антитела с требуемыми характеристиками. Чаще всего для этого используется иммуноферментный анализ, позволяющий быстро и точно определить уровень и специфичность синтезируемых антител.
7. Массовое наращивание антител. После отбора гибридом, которые демонстрируют необходимую производительность, приступают к масштабному культивированию клеток. Для этого используются биореакторы или специализированные лабораторные условия, позволяющие создать оптимальную среду для размножения клеток и синтеза антител в больших объемах.
8. Очистка полученных антител. На этапе очистки удаляются примеси, чтобы получить продукт с заданным уровнем чистоты. Степень очистки зависит от цели применения. Для диагностических целей достаточно чистоты на уровне 70-95%, тогда как для использования в терапии, особенно противоопухолевой, требуется более высокая степень очистки. Для этого применяются методы аффинной и ионообменной хроматографии.
9. Удаление примесей и обеззараживание. Финальная стадия включает устранение оставшихся загрязнений и патогенных микроорганизмов, включая вирусы и бактерии. Это обеспечивает безопасность и соответствие готового продукта строгим медицинским стандартам.

На сегодняшний день наблюдается активная тенденция отказа от использования антител животного происхождения в лечебных целях. Это связано с несколькими важными факторами. Во-первых, такие антитела воспринимаются организмом человека как чужеродные агенты, что может вызывать аллергические реакции, включая опасные для жизни состояния, такие как анафилаксия. Во-вторых, иммунная система человека стремится нейтрализовать эти антитела, что значительно снижает их эффективность, особенно в рамках противоопухолевой терапии.

Однако получение человеческих моноклональных антител с использованием традиционного метода сопряжено с рядом серьёзных трудностей:

• Иммунизация человека антигенами неэтична и противоречит медицинским нормам.
• Даже при наличии иммунизированных лимфоцитов человека возникают проблемы с их слиянием с миеломными клетками мышей, так как образовавшиеся гибридомы оказываются нестабильными.
• На данный момент невозможно создать устойчивые клеточные линии человеческой миеломы, которые могли бы эффективно использоваться для производства антител.

Для преодоления этих ограничений были разработаны новые подходы, включающие производство гибридных, гуманизированных и одноцепочечных антител. Эти методы основываются на гибридомной технологии, дополненной использованием рекомбинантной ДНК.

Гибридные (химерные) антитела — это антитела, в которых константный домен заменён на фрагмент иммуноглобулина человека. Их получают с помощью рекомбинантной ДНК: участок мышиной ДНК, отвечающий за синтез константного домена, удаляется и заменяется аналогичным участком ДНК человека. В результате вариабельный домен, обеспечивающий взаимодействие с антигеном, сохраняет мышиное происхождение, тогда как константный домен становится человеческим. Это снижает аллергенность и иммуногенность антител, позволяя организму воспринимать их как "свои".

Гуманизированные антитела содержат минимальный процент мышиного белка, ограничиваясь только антигенсвязывающими гипервариабельными участками домена. Это ещё больше уменьшает риск иммунных осложнений.

Одноцепочечные антитела представляют собой упрощённые версии антител, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном и выполнять свою функцию, но лишены константного домена. Их минимальная структура делает такие антитела менее иммуногенными и более универсальными в применении.

Механизм действия моноклоналных антител

Моноклональные антитела являются важным инструментом в терапии заболеваний с иммунным компонентом в патогенезе. Они успешно применяются при лечении таких состояний, как псориаз, аутоиммунные патологии, ревматоидный артрит, рассеянный склероз. Особенно значимы эти технологии в онкологии, где они используются в рамках таргетной терапии. Эффективность антител обусловлена их способностью воздействовать на клетки с использованием различных механизмов:

• Изменение клеточных сигналов. Некоторые злокачественные клетки обладают повышенным количеством рецепторов факторов роста, которые активируют процессы, способствующие быстрому размножению клеток. Моноклональные антитела блокируют такие рецепторы, предотвращая их взаимодействие с лигандами (факторами роста). Это приводит к тому, что каскад реакций, обеспечивающий клеточное деление, не запускается. В результате клетка теряет способность активно размножаться и со временем погибает.
• Комплемент-зависимая цитотоксичность. Этот механизм заключается в активации системы комплемента, которая является частью иммунной защиты организма. Моноклональные антитела связываются с антигенами на поверхности злокачественных клеток, инициируя активацию каскада комплемента. Завершающим этапом становится образование белка С9, который разрушает мембрану опухолевой клетки, вызывая её гибель.
• Усиление цитотоксического воздействия иммунных клеток. Моноклональные антитела способны активировать клетки иммунной системы, такие как макрофаги. Это усиливает их способность распознавать и уничтожать злокачественные клетки путём фагоцитоза.
• Развитие адаптивного иммунитета. Одной из причин прогрессирования опухолей является неспособность иммунной системы распознавать злокачественные клетки как чужеродные. Моноклональные антитела выполняют роль «посредников», подсвечивая опухоль иммунным клеткам. Это способствует запуску адаптивного иммунного ответа, в результате чего организм начинает самостоятельно бороться с опухолью.

Препараты с моноклональными антителами

Препараты, созданные на основе моноклональных антител, уже более двух десятилетий занимают важное место в протоколах лечения злокачественных опухолей. В 2008 году Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) утвердила рекомендации по стандартизации непатентованных наименований таких препаратов.

Названия препаратов обязательно оканчиваются на «-маб» (сокращение от английского monoclonal antibody).

Для обозначения происхождения моноклональных антител в названии применяются следующие подосновы:

• -аксо — для гибридных антител.
• -о — для антител мышиного происхождения.
• -кси — для химерных антител.
• -у — для антител человеческого происхождения.

На данный момент выделяют два основных типа препаратов, созданных на основе моноклональных антител:

1. Неконъюгированные антитела. Эти антитела действуют непосредственно на механизмы, приводящие к гибели злокачественной клетки.
2. Конъюгированные антитела. Такие антитела соединены с токсическими или радиоактивными веществами. Основное действие оказывается именно этими связанными веществами, которые уничтожают опухолевые клетки.

Применение неконъюгированных антител

Неконъюгированные моноклональные антитела являются наиболее часто используемым типом препаратов. Их основной задачей является связывание с определёнными рецепторами на поверхности злокачественных клеток, что приводит к активации механизмов, направленных на их уничтожение.

Одним из первых таких препаратов стал ритуксимаб. Его одобрили для лечения CD20+ В-клеточных лимфом. Рецептор CD20 присутствует на поверхности В-лимфоцитов, как нормальных, так и опухолевых, но отсутствует на других тканях и клетках, включая стволовые. Благодаря этому терапия ритуксимабом уничтожает популяцию В-лимфоцитов, а последующее восстановление клеток обеспечивается здоровыми стволовыми клетками, остающимися нетронутыми.

Неконъюгированные антитела также могут выполнять функцию "маркеров", делая злокачественные клетки заметными для иммунной системы. Например, алемтузумаб связывается с рецептором CD52 на лимфоцитах, что привлекает внимание иммунных клеток и способствует уничтожению опухолевых клеток.

Ещё одной важной группой неконъюгированных антител являются ингибиторы рецепторов факторов роста. Эти антитела блокируют рецепторы, к которым присоединяются молекулы факторов роста, инициирующие деление клеток. У злокачественных клеток таких рецепторов может быть значительно больше, что ускоряет их размножение. Блокирование рецепторов антителами, такими как трастузумаб или цетуксимаб, останавливает этот процесс, не позволяя клеткам бесконтрольно делиться.

Неконъюгированные антитела также эффективно подавляют ангиогенез — процесс образования новых кровеносных сосудов, необходимых опухоли для доставки питательных веществ и кислорода. Моноклональные антитела блокируют сигнальные молекулы, стимулирующие ангиогенез, или разрушают уже сформированную сосудистую сеть внутри опухоли. Это приводит к ухудшению питания опухоли и замедлению её роста. Среди препаратов этой группы можно выделить рамуцирумаб и бевацизумаб.

Применение конъюгированных антител

Конъюгированные моноклональные антитела представляют собой мощный инструмент в терапии онкологических заболеваний. Особенностью этих препаратов является их способность доставлять разрушающие агенты — цитотоксические или радиотоксические вещества — непосредственно к злокачественным клеткам, минимизируя воздействие на здоровые ткани.

Примером такого препарата является ибритумомаб (торговое название Зевалин). Это антитело, направленное против CD20, маркера, присутствующего на В-лимфоцитах. Ибритумомаб связан с радиоактивным изотопом иттрием-90, который оказывает мощное разрушительное воздействие на опухолевые клетки. Данный препарат применяется для лечения В-клеточных лимфом.

Ещё одним примером является Кадсила — инновационный препарат, сочетающий антитело трастузумаб с цитотоксическим веществом DM1, ингибирующим микротрубочки. Кадсила успешно используется для лечения рака молочной железы, обеспечивая целенаправленное уничтожение опухолевых клеток.

Конъюгированные антитела представляют собой перспективное направление современной терапии, позволяя не только повышать эффективность лечения, но и снижать риск побочных эффектов благодаря их высокой специфичности.

Проблемы при использовании моноклональных антител

Несмотря на высокий потенциал моноклональных антител в лечении онкологических заболеваний, их использование не является универсальным решением и сопряжено с рядом проблем:

1. Биологическая и биохимическая нестабильность. Препараты на основе моноклональных антител, особенно конъюгированные формы, характеризуются нестабильностью, что требует соблюдения строгих условий производства, хранения и транспортировки. Нарушение этих условий может привести к снижению их эффективности.
2. Слабое проникновение в опухоль. Антитела плохо проникают в глубину опухолевой ткани, что ограничивает их действие и снижает терапевтический эффект.
3. Иммунный ответ против препарата. Многие моноклональные антитела, особенно мышиного происхождения, вызывают иммунный ответ организма. У 75% пациентов, получающих такие препараты, наблюдается выработка нейтрализующих антител, которые блокируют действие лекарства, снижая его эффективность.
4. Токсическое действие. Хотя токсичность моноклональных антител ниже, чем у традиционных цитостатиков, в ряде случаев она может быть значительной и требовать отмены препарата.
5. Гетерогенность опухолевых клеток. Высокая специфичность моноклональных антител одновременно является их слабостью. Не все раковые клетки имеют молекулы-мишени, на которые направлено действие препарата. Такие клетки остаются невосприимчивыми к терапии, что приводит к накоплению резистентной клеточной массы и снижению эффективности лечения.

Для преодоления этих ограничений ведётся разработка новых типов антител. Одним из перспективных направлений являются биспецифические антитела, которые способны связываться сразу с двумя молекулярными мишенями. Например, препарат блинатумомаб действует одновременно на два маркера В-лимфоцитов — CD19 и CD22. Это повышает эффективность терапии, позволяя распознавать и атаковать злокачественные клетки даже после их трансформации.

Несмотря на существующие трудности, моноклональные антитела остаются одним из наиболее перспективных направлений в онкологии. Постоянное совершенствование технологий их производства и разработки позволяет преодолевать текущие проблемы и повышать эффективность и безопасность лечения.

Список литературы:

1. Авдеева Ж.И., Солдатов А.А., Киселевский М.В., Медуницын Н.В. "Противоопухолевые моноклональные антитела" Иммунология, т. 38, № 5, 2022.
2. Будчанов Ю.И. "Моноклональные антитела: от создания до клинического применения" Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика, т. 9, № 3, 2019.
3. Чмутин Е. Ф., Иванов П. К., Барышников А. Ю. "Противоопухолевые препараты на основе моноклональных антител" Российский биотерапевтический журнал, т. 3, № 2, 2022.
4. Филиппова (Гурьянова) А.В., Колбин А.С., Вербицкая Е.В., Глаголев С.В., Поливанов В.А., Мазуров В.И., Самигуллина Р.Р. "Вопросы безопасности лекарственных средств моноклональных антител, применяемых в ревматологии" Качественная клиническая практика, № 3, 2019.
5. Нуржанова А.Б., Табачкова О.А.. "Моноклональные антитела – новое направление современной фармакотерапии" Бюллетень медицинских интернет-конференций, т. 4, № 12, 2018.
6. Ваганова О.А., Ефремова Т.А., Миронов А.Н., Меркулов В.А., Сакаева И.В. "Направления совершенствования лекарственных препаратов моноклональных антител" Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения, № 1, 2024.